火焰衛矛組織培養再生體系優化
發布者：華石紅楓 發布日期：2014-06-22 點擊次數：2099162
火焰衛矛(Euonymus alatus 'compacta')屬于衛矛科落葉灌木,因其葉片里火焰紅色而具有重要的園藝觀賞和經濟價值,每株成熟的火焰衛矛每年能生產成百上千粒種子。由于通過鳥類和流水的傳播,火焰衛矛在美國非常流行,甚至不可控制,破壞其他植物區系,嚴重威脅生態平衡。本研究以火焰衛矛為研究對象,優化了植株組織培養再生體系,并在此基礎上探索農桿菌介導火焰衛矛遺傳轉化技術,為利用基因工程技術對火焰衛矛進行遺傳改良打下了基礎。主要研究結果如下: (1)火焰衛矛植株組培再生體系優化 本研究以火焰衛矛成熟胚培養長出的子葉、下胚軸為外植體進行組織培養及植株再生研究,優化了火焰衛矛組織培養再生體系。研究結果表明:成熟胚培養基為WPM+TDZ0.5mg·L~(-1);愈傷組織誘導培養基為WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽分化培養基為WPM+6-BA6 mg·L~(-1)+IBA0.2 mg·L~(-1);不定芽增殖和壯苗培養基為WPM+6-BA4 mg·L~(-1);生根培養基為1/2MS+NAA0.2 mg·L~(-1)+AC0.5 g·L~(-1)。移栽基質為營養土,成活率為83.3%。 (2)農桿菌介導火焰衛矛遺傳轉化體系建立 以火焰衛矛子葉和下胚軸為轉化受體進行遺傳轉化體系研究,確定了子葉和下胚軸不定芽分化的有效卡那霉素(kan)篩選壓分別為60 mg·L~(-1)和50 mg·L~(-1);而在抑菌劑頭孢霉素(cef)和特美汀(Timentin)濃度對比研究中發現,Timentin對不定芽分化的影響要小于頭孢霉素(Cef)的影響,Timentin濃度為400 mg·L~(-1)時,子葉分化率達到23.89%,而Cef在相同濃度下子葉分化率僅為15.56%;并確定Timentin最佳抑菌濃度為200 mg·L~(-1)。探討了遺傳轉化過程中外植體預培養時間、共培養時間、浸染菌液濃度和浸染時間對遺傳轉化效率的影響。結果表明,外植體預培養2 d,共培養3d,菌液濃度OD600為0.4～0.5,浸染6 min為最佳技術參數;在YEP液體培養基中添加100μmol·L~(-1)AS可提高轉化率8.8%。 (3)轉基因植株篩選鑒定 通過農桿菌介導法遺傳轉化火焰衛矛,并對轉化植株進行GUS組織活性及PCR檢測,證明由Barnase和iaaM組成的超級不育表達元件已經整合到火焰衛矛植株,從78株抗性植株中篩選出轉基因植株3株。
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